用于原核表達系統的自誘導培養基，該培養基能高效誘導表達外源蛋白。培養基中同時加入葡萄糖和乳糖，大腸桿菌會優先利用葡萄糖，在葡萄糖耗盡前不會誘發Iac啟動子；當葡萄糖耗盡時，乳糖發揮作用，開啟Iac啟動子誘導外源蛋白表達，而乳糖的代謝產物也同時作為細菌生長的碳源。自誘導的方法省去了監測培養基的菌密度和添加IPTG誘導蛋白表達的步驟，一方面使得實驗操作更加簡潔，另一方面避免了IPTG對細菌的毒害作用。
自誘導培養基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)產品及特點
本產品是在pET專用生長培養基的基礎上開發而成的,它利用E.coli自身對培養 基中碳源和能源的調控利用機制,實現外源蛋白在細菌達到飽和期后的自動誘發。
具有下列特點:
1. 不需添加任何IPTG或相關誘導物,節約成本。
2. 免去了密切監控菌液密度的過程,尤其適合大規模篩選 。
3. 細菌生長密度遠高于IPTG誘導表達系統 。
4. 外源蛋白表達量遠遠高于IPTG誘導表達系統。
5. 本產品即開即用,操作簡單 。
6. 與各種細胞培養容器兼容(如培養瓶、培養罐、深孔管、發酵罐等)。
自誘導培養基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)使用及效果
用本產品以及LB+IPTG誘導培養細菌獲得的外源蛋白表達量比較
自誘導培養基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)操作步驟
(一)獲得目的基因
1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質粒為模板,按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環獲得所需基因片段。
2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉錄形成cDNA第一鏈,以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。
(二)構建重組表達載體
1、自誘導培養基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)載體酶切:將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2、PCR產物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
(三) 獲得含重組表達質粒的表達菌種
1、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5α,根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質粒,雙酶切初步鑒定。
2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3、 以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。
(四)誘導表達
1、 自誘導培養基(lac啟動子)(Auto-induction Medium)挑取含重組質粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。
2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中, 37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。
3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續37℃震蕩培養3hr。
4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。
5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
